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Akt 信号转导

自首次被发现是一种原癌基因之后,丝氨酸/苏氨酸激酶 Akt(又称蛋白激酶 B 或 PKB)已成为主要的关注热点,因为它在癌症进展和胰岛素代谢等不同细胞过程中发挥关键的调节作用。Akt 有三种高度相关的同工型(Akt1、Akt2 和 Akt3),这些代表着 PI3K 的主要信号转导臂结构。

Akt IF #4060

磷脂结合以及羧基末端 Ser473 磷酸化均会激活 Akt。

对未经处理或已经 LY294002 #9901(一种会抑制 Akt 磷酸化的特殊 PI3 激酶抑制剂)处理的 LNCaP 前列腺癌细胞沉淀物(结果图 A)以及人乳腺癌细胞(结果图 B)进行 IHC。

首先对细胞沉淀物确定 Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XP® Rabbit mAb #4060 和竞争对手的磷酸化 Akt 抗体的最佳稀释度(结果图 A)。

随后使用这种稀释度来对人乳腺癌组织比较两种抗体(结果图 B)。#4060 的靶标特异性染色显著较强,并且比公司 1 的抗体更为明显。

在对细胞沉淀物进行检测时,抗体染色虽然看起来十分相似,但组织染色需要较高水平的抗体敏感性,因此 #4060 是更适合对组织切片进行 IHC 的抗体。

IHC 结果图 A IHC 结果图 B

结果图 A.

功能:磷脂结合以及羧基末端 Ser473 磷酸化均会激活 Akt。

样品:C2C12 小鼠肌祖细胞用 LY294002 #9901(一种会抑制 Akt 磷酸化的特殊 PI3 激酶抑制剂)或会诱导 Akt 磷酸化的胰岛素处理。

IF 结果图 A

结果:实验中使用的抗体浓度如下:

  • #4060 的浓度为 0.375 μg/ml
  • 竞争对手 1 抗体的浓度为 0.5 或 2 μg/ml
  • 在用胰岛素刺激后,使用 CST 的 #4060(绿色)对起皱的膜/前缘堆积物进行适当染色,并且显示在经 LY294002 处理的细胞上几乎没有染色。
  • 公司 1 抗体(浓度为 2 μg/ml)显示出非常高的细胞浆染色,其中在经 LY294002 处理的细胞中有一些分散的胞核背景,信号强度与在经胰岛素处理的细胞中的 #4060 具有可比性。稀释度为 0.5 μg/ml 时,在经胰岛素处理的细胞中,竞争公司 1 抗体信号较 #4060 弱。

该数据表明,使用更少 #4060 抗体可产生更强的信号。

IF 结果图 B

结果图 B.

结果: 实验中使用的抗体浓度如下:

  • #4060 的浓度为 0.375 μg/ml
  • 公司 2 抗体的浓度为 0.625-1.25 μg/ml
  • 在用胰岛素刺激后,使用 #4060(绿色)对起皱的膜/前缘堆积物进行适当染色,并且显示在经 LY294002 处理的细胞上几乎没有染色。
  • 公司 2 抗体(浓度为 1.25 μg/ml)在经 LY294002 和胰岛素处理的细胞(背景更高)中均显示出明显的胞核背景。抗体浓度为 0.625 μg/ml 时,在用胰岛素处理的细胞中几乎无法检测到信号。

该数据表明,使用更少 #4060 抗体可产生更强的信号。

功能:磷脂结合和羧基末端 Ser473 磷酸化会激活 Akt。

样品:Jurkat 细胞用 Calyculin A #9902(一种有效的磷酸酶抑制剂)处理来保留现存的 Akt 磷酸化水平,或用 LY294002 #9901(一种特殊的 PI3 激酶抑制剂)处理,以通过 PI3 激酶抑制 Akt 磷酸化。

蛋白质印迹实验比较
  • CST 的 Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XP® Rabbit mAb #4060 在经 Calyculin A 处理的 Jurkat 裂解物中可识别出 60 kDa 的高特异性条带。
  • 公司 1 的磷酸化 Akt (Ser473) 兔多克隆抗体可识别出相应条带以及大约 75 kDa 的交叉反应性条带。该抗体对磷酸化 Akt 没有特异性。
  • 除了相应条带,公司 2 的磷酸化 Akt (Ser473) 兔多克隆抗体还显示出明显的背景条带,并且目的条带的信号较其他交叉反应性条带弱。
  CST #4060 竞争公司 1 竞争公司 2
产品 4060    
稀释度 1:2000 1:200* 1:2500*
浓度 (μg/mL) 0.043 0.5 0.2

*制造商建议的起始稀释度。

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